知柏地黄丸的UPLC指纹图谱研究

王常顺，刘永利，冯丽*

(河北省药品检验研究院，石家庄 050011)

摘要：目的 建立知柏地黄丸UPLC指纹图谱的研究方法。方法 采用Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 µm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱，检测波长236 nm，流速0.4 mL·min-1，柱温40 ℃，以丹皮酚作为参照物。结果 在12 min内完成指纹图谱分析，标出12个共有峰，对6个色谱峰进行了归属，并进行了相似度评价。结论 UPLC简便可行，建立的指纹图谱可用于知柏地黄丸的质量控制。

关键词：知柏地黄丸；指纹图谱；UPLC；相似度

知柏地黄丸源于明代著名医学家张景岳所著《景岳全书》，原名为滋阴八味丸，到清代董西园编著《医级》卷十二中更名为知柏地黄丸[1]，由滋补肾阴经典名方“六味地黄丸”加知母、黄柏制成。方中熟地黄占处方比例的27.6%，益精填髓，为君药；山茱萸、山药助熟地黄滋肾补阴；知母清虚热、滋肾阴；黄柏泻虚火、坚真阴；诸药合为臣药。茯苓健脾渗湿，泽泻利水清热，丹皮清热凉血，三药合用共为佐药。诸药配合，具有滋阴降火之功效[2]。用于阴虚火旺，潮热盗汗，口干咽痛，耳鸣遗精，小便短赤[3]。药理学研究表明，知柏地黄丸在内分泌系统疾病、生殖系统疾病、泌尿系统疾病、儿科疾病、妇科疾病方面亦有较好疗效[1]。知柏地黄丸成分复杂，生产厂家众多，法定检验标准仅测定了马钱苷和丹皮酚含量，不足以全面评价其质量。中药指纹图谱是运用现代分析技术对中药化学信息以图形的方式进行表征并加以描述，是一种综合分析多种成分的有效手段[4-7]。近年来，UPLC广泛应用于中药分析领域[8-17]，本研究 UPLC与中药指纹图谱技术结合，简便有效地为知柏地黄丸的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司，二元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器)；AE240、AE163电子天平(瑞士Mettler公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merk公司)，其他试剂为分析纯；超纯水(美国 Millipore公司)。莫诺苷(批号：111998-201501，含量以96.8%计)、芒果苷(批号：111607-201503，含量以98.4%计)、马钱苷(批号：111640-201606，含量以98.3%计)、芍药苷(批号：110736-201539，含量以96.4%计)、盐酸小檗碱(批号：110713-201212，含量以86.7%计)、丹皮酚(批号：110708-201407，含量以 99.9%计)均为中国食品药品检定研究院提供。熟地黄、山茱萸、知母、黄柏、牡丹皮对照药材(批号分别为121196-201105，121495-200702，121070-201105，121510-201105，121490-201102，中国食品药品检定研究院)。23批样品来源于全国8个生产企业(规格：大蜜丸，每丸重9 g)，详见表1。

表1 23批知柏地黄丸样品信息
Tab. 1 Information of 23 batches of Zhibai Dihuang Pills

编号 生产企业 批号S1 A 15010215 S2 A 15013373 S3 B 1603055 S4 C 150401 S5 A 15011127 S6 D 160401 S7 D 150903 S8 D 160402 S9 A 15013373 S10 A 15010215 S11 C 150201 S12 A 15012039 S13 E 16021006 S14 F 20160501 S15 A 15011127 S16 G 11160119 S17 B 1603058 S18 B 151220 S19 A 15012037 S20 H 5460066 S21 C 160301 S22 C 150301 S23 E 15051019

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 µm)，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱：0～4 min，7%A；4～8 min，7%→13%A；8～12 min，13%→65%A；检测波长：236 nm；流速：0.4 mL·min-1，进样量：1 µL。

2.2 对照品和对照药材溶液制备

精密称取对照品适量，加 50%甲醇制成每1 mL含莫诺苷12.44 μg、芒果苷12.53 μg、马钱苷 22.02 μg、芍药苷 13.36 μg、盐酸小檗碱29.35 μg、丹皮酚23.98 μg的混合溶液，即得混合对照品溶液。再取熟地黄、山茱萸、黄柏、牡丹皮对照药材各0.5 g，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用 50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

2.3 供试品溶液制备

取质量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取约0.5 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 仪器精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，测得其各共有峰的相对保留时间RSD均＜1.2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批样品(批号：150301)，分别精密称取0.5，1.0，1.5 g各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，测得其各共有峰的相对保留时间 RSD均＜0.9%，表明重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下方法分别在0，1，3，5，7，20，24 h进样测定，测得其各共有峰的相对保留时间RSD＜1.3%，表明样品在24 h内保持稳定。

2.5 样品测定

取23批大蜜丸样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，并标定出12个共有峰，以峰12为参照峰，各共有峰的相对保留时间分别为0.12，0.24，0.27，0.31，0.57，0.62，0.65，0.69，0.73，0.94，0.97，1.00。结果见图1。

2.6 对照指纹图谱的建立与色谱峰指认

取不同生产企业的样品，按“2.1”项下方法分别进样测定，将不同企业合格样品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，生成对照指纹图谱，经与对照药材溶液图谱比对，指纹图谱中峰 1归属为熟地黄，峰 3、5、6归属为知母，峰 2、4、7归属为山茱萸，峰 8、10归属为黄柏，峰 9、11、12归属为牡丹皮。经与对照品溶液图谱比对，峰4、5、7、9、10、12分别为莫诺苷、芒果苷、马钱苷、芍药苷、盐酸小檗碱、丹皮酚。结果见图2。

2.7 指纹图谱分析

2.7.1 相似度考察 以“2.6”项下生成的对照指纹图谱为参照，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，多点校正，全峰匹配，分别计算23批样品的相似度，结果23批样品的相似度分别为 0.936，0.962，0.979，0.986，0.986，0.981，0.948，0.968，0.964，0.964，0.895，0.965，0.900，0.979，0.986，0.897，0.981，0.965，0.962，0.953，0.992，0.976，0.979。以样品编号为X轴，相似度结果为Y轴，绘制散点图，结果见图3。由图3可见，样品 S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S9，S10，S12，S14，S15，S17，S18，S19，S20，S21，S22，S23的相似度均＞0.93，样品S11，S13，S16的相似度均＜0.93。

图1 23批知柏地黄丸UPLC指纹图谱
4-莫诺苷；5-芒果苷；7-马钱苷；9-芍药苷；10-盐酸小檗碱；12-丹皮酚；1～3，6，8，11-共有峰。
Fig. 1 UPLC fingerprint overlap of 23 batches of Zhibai Dihuang pills
4-morroniside; 5-mangiferin; 7-loganin; 9-peoniflorin; 10-berberine; 12-paeonol; 1-3, 6, 8, 11-common peaks.

图2 知柏地黄丸对照指纹图谱
4-莫诺苷；5-芒果苷；7-马钱苷；9-芍药苷；10-盐酸小檗碱；12-丹皮酚；1～3，6，8，11-共有峰。
Fig. 2 Referential fingerprint chromatogram of Zhibai Dihuang pills
4-morroniside; 5-mangiferin; 7-loganin; 9-peoniflorin; 10-berberine;12-paeonol; 1-3, 6, 8, 11-common peaks.

图3 23批样品相似度散点图
Fig. 3 Scatter plot of similarity analysis in 23 batches sample

2.7.2 聚类分析 以峰12为参照峰，计算其他共有峰的相对峰面积，将相对峰面积数据导入SPSS 19.0，对23批样品进行聚类分析，聚类方法采用Ward法，度量标准采用平方Euclidean距离，结果见图4。23批样品被分为2类，S6，S7，S8，S21，S22聚为一类，其余样品聚为一类。

图4 23批样品树状聚类分析
Fig. 4 Result of clustering analysis

2.7.3 主成分分析 将共有峰相对峰面积数据导入SPSS 19.0，进行主成分分析，结果提取了一个主成分，以编号为X轴，样品得分为Y轴，绘制散点图，见图5。由图5可见，样品S6，S7，S8，S21，S22聚为一类，其余样品聚为一类，与“2.7.2”聚类分析考察结果一致。样品S6，S7，S8为同一生产企业样品，S21，S22为同一企业样品，表明这2个企业样品与其他企业样品有较大差异。

图5 23批样品主成分分析
Fig. 5 Result of principal component analysis in 23 batches sample

2.8 6成分含量测定

对23批样品进行了莫诺苷、芒果苷、马钱苷、芍药苷、盐酸小檗碱、丹皮酚 6成分含量测定，测定结果见表2。

表2 样品中6种成分含量
Tab. 2 Contents of six components in samples mg·g-1

编号 莫诺苷 芒果苷 马钱苷 芍药苷 盐酸小檗碱 丹皮酚S1 0.79 0.32 0.68 0.83 1.02 1.25 S2 0.54 0.41 0.55 0.73 0.77 1.07 S3 0.75 0.31 0.63 0.76 0.98 1.24 S4 0.84 0.29 0.72 0.43 0.82 0.77 S5 0.76 0.28 0.7 0.44 0.87 0.86 S6 0.59 0.24 0.69 0.43 0.72 0.99 S7 0.88 0.29 0.71 0.66 0.80 0.90 S8 1.04 0.28 0.61 0.68 0.57 1.12 S9 0.82 0.33 0.67 0.67 1.25 0.88 S10 0.80 0.29 0.64 0.65 0.84 0.86 S11 0.38 0.23 0.50 0.51 0.74 1.07 S12 0.64 0.05 0.75 0.74 0.83 1.33 S13 0.45 0.29 0.59 0.44 0.87 1.00 S14 0.74 0.34 0.74 0.52 0.87 0.77 S15 0.53 0.26 0.63 0.58 0.81 1.31 S16 0.77 0.29 0.76 0.46 0.47 0.85 S17 0.43 0.27 0.54 0.52 0.86 1.27 S18 0.53 0.29 0.55 0.52 0.85 1.19 S19 0.37 0.29 0.55 0.43 0.81 0.97 S20 0.51 0.33 0.57 0.51 0.88 1.15 S21 0.50 0.11 0.59 0.44 0.57 0.93 S22 0.26 0.35 0.53 0.38 0.92 0.77 S23 0.57 0.34 0.64 0.64 0.89 1.03

3 讨论

3.1 供试品溶液制备的考察

考察了回流 1 h直接进样和回流后过中性氧化铝柱 2种制备方法，结果过柱后特征峰减少，有效成分含量测定结果降低，故选择回流后直接进样。

3.2 色谱条件的选择

在 200～400 nm 进行全波长扫描，结果在236 nm处色谱峰大小适中，分离较好，所以选择其作为测定波长。试验时考察了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.2%磷酸水系统，考察了0.3，0.4 mL·min-1等不同的流速，35 ℃和 40 ℃等柱温条件，尝试了不同的流动相梯度洗脱，结果乙腈-0.1%磷酸水，0.4 mL·min-1，40 ℃柱温下各色谱峰分离良好。考察了 3根同型号 Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 µm)，各共有峰相对保留时间变化差异较小。

3.3 相似度评价

相似度＜0.93的S11样品，1号峰(归属为熟地黄)峰高和峰面积明显低于其他样品，S13样品 3号、5号(归属为知母)峰较小，S16样品10号峰(归属为黄柏)明显低于其他样品，经测定，10号峰盐酸小檗碱含量低于理论值，因此将0.93作为相似度评价的阀值，可有效对样品质量优劣进行评价。

3.4 聚类分析

聚类分析与主成分分析结果一致，但与相似度评价结果不同，因为相似度评价采用的是较好的10批合格样品生产的对照指纹图谱为参比，评价结果反映的是样品与对照的一致程度，而统计分析是通过统计学手段去发现所有样品的规律。

3.5 6成分含量测定

多数产品含量测定结果高于拟定限度，尤其是药典中有量化控制指标的山茱萸、牡丹皮，其莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、芍药苷含量均较高，而知母、黄柏等未控制含量的处方药味，其主要活性成分芒果苷和盐酸小檗碱的测定均发现低于拟定限度样品，可能与知母、黄柏药材产地、采收期等原因有关。同一生产企业样品批间差异不大，不同生产企业样品差异亦在合理范围。

综上所述，本实验建立的知柏地黄丸 UPLC指纹图谱研究方法高效准确、专属性强，为快速评价其质量提供了依据。

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Study on UPLC Fingerprint of Zhibai Dihuang Pills

WANG Changshun, LIU Yongli, FENG Li*
(Hebei Insititute for Drug Control, Shijiazhuang 050011, China)

ABSTRACT:OBJECTIVE To develop a method for fingerprint study of Zhibai Dihuang pills by UPLC. METHODS The chromatographic condition was as follows: Waters Acquity BEH C18column(2.1 mm×100 mm, 1.7 µm), using acetonitrile-0.1% H3PO4as mobile phase, with a flow rate of 0.4 mL·min-1, the detective wavelength was set at 236 nm and the column temperature was 40 . ℃Paeonol was used as the reference substance. RESULTS The analysis time was 12 min. There were 12 common peaks in the fingerprints, 6 peaks were identified and the similarity of the fingerprint was compared. CONCLUSION The method is simple, feasible, and can be used for qulity control of Zhibai Dihuang pills.

KEY WORDS:Zhibai Dihuang pills; fingerprint; UPLC; similarity

REFERENCES

中图分类号：R284.1

文献标志码：B

文章编号：1007-7693(2017)10-1432-05

DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.10.015

引用本文：王常顺, 刘永利, 冯丽. 知柏地黄丸的UPLC指纹图谱研究[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(10): 1432-1436.

作者简介：王常顺，硕士，药师 Tel: 13473763144 E-mail: shunzi20080508@126.com*

通信作者：冯丽，女，主任药师 Tel:(0311)85210960 E-mail: Jianyan882@163.com

收稿日期：2017-02-27

(本文责编：李艳芳)